В XIV веке начинается масштабное объединение Московского государства . В 1320 году Нижегородско-Суздальское великое княжество присоединяют к Москве и Нижний Новгород становится центром Нижегородского уезда. В царствование Василия III Нижний Новгород становится значимым сторожевым постом, обзаводится постоянным войском и является сборным местом во время походов на Казанское Ханство. Тогда же взамен старого деревянного строится новый каменный Нижегородский кремль. После походов Василия III и покорения Казани Иваном Грозным пограничные обязанности города сначала ослабли, а потом и вовсе прекратились.
В Смутное время город продолжал поддерживать Москву. Особо важную роль в освобождении Москвы от польско-литовских захватчиков сыграло народное Нижегородское ополчение, руководимое Кузьмой Мининым и Дмитрием Пожарским.
В XVII веке в ходе церковного раскола в православной церкви при патриархе Никоне в окрестностях города появились многочисленные поселения старообрядцев. Для искоренения раскола в 1672 году в Нижнем Новгороде основывается метрополия, а в 1719 году Нижегородская епархия.