После присоединения в 1552 г. к Московии Казани и в связи с отсутствием татарских поселений в районе Самарской Луки дали возможность возродить русское судоходство по водам Волги. Тут же возникла необходимость охраны судоходного участка от нападений со стороны казаков Жигулевской вольницы и ногайских татар. Для этих целей в 1584 г. царем Федором Иоанновичем был издан приказ о возрождении опустевшего 65 лет назад поселения Самары у вершины Самарской Луки в качестве военно-стратегической крепости.
Крепость изначально строилась на возвышенном мысе в 2 верстах от правого берега Волги и 20 верстах от древней пристани Самар (в современном городе на этом месте располагается Хлебная площадь). Военно-сторожевое назначение крепости определялось постоянной опасностью со стороны кочевых народов Заволжья – калмыков и башкиров. Вскоре отдаленное расположение превратило крепость в место ссылки (первым в 1586 г. сюда был сослан один из противников Бориса Годунова, Андрей Иванович Шуйский).
Вскоре Самара стала местом пересечения торгово-экономических интересов Русского государства и среднеазиатских ханств. В 1600 г. была образована таможня, а чуть ниже по течению Волги – пристань.